GMM解复用器

GMM-Demux 是一种基于 Gaussian-Mixture-Model 的软件，用于处理样本条形码数据（单元散列和 MULTI-seq）。

GMM-Demux 识别样本条码数据集中的多样本多重态 (MSM)。下面显示了 PBMC scRNA-seq 数据集中 MSM 的示例分布。散点图中的橙色点是 MSM。

描述

GMM-Demux 删除单元散列数据集中的多样本多重 (MSM)，并估计剩余数据集中相同样本多重 (SSM) 和单重的百分比。GMM-Demux 还验证推定的细胞类型是否存在，或者它仅仅是由多重细胞诱导的伪影。

多重诱导的假细胞类型称为“假细胞类型”。

下图提供了 PBMC CITE-seq 数据集中的假细胞类型示例：

在上图中，CD3+CD19+ 和 CD4+CD8+ 细胞类型都是多重诱导的假细胞类型。

如上图所示，假类集群具有很大比例的 MSM。两种虚假类型的集群都具有较大的 MSM 百分比。

GMM-Demux 使用 MSM 的百分比作为关键特征来对 GEM 集群进行分类。

术语

• Singlet：包含单个细胞的液滴。

• MSM：多样本多重。MSM 是一个多重态，它包含来自不同样本的样本条形码中的细胞。GMM-Demux 可以识别 MSM。

• SSM：同样本多重态。SSM 是一个多重态，它包含来自样本条形码中单个样本的细胞。SSM 不能通过样本条码与单峰分开。

• SSD：相同样品液滴。SSD 是 SSM 和单线态的组合类别。

• 纯型：纯型细胞类型是存在于组织中的真实细胞类型。

• 假细胞类型：假细胞类型是一种人工细胞类型，它是由多重细胞产生的人工产物。

• 混合型：混合型细胞类型是一簇液滴，其中存在非平凡部分的假型液滴。

下图提供了 PBMC 数据集中上述术语的说明：

特征

• 从数据集中删除单元散列可识别的多重态（即 MSM）。
• 估计剩余数据集中的单元散列不可识别多重态 (SSM) 的比例（RSSM 百分比）。
• 测试假定的细胞类型是纯（真实）细胞类型还是假（假）细胞类型。

示例数据集

• example_input文件夹中提供了一个示例单元格哈希数据集。它包含 4 个样本单元散列库准备的每滴 HTO 计数矩阵。输入文件夹具有与 CellRanger v3 输出相同的文件格式。

作者

Hongyi Xin, Qi Yan, Yale Jiang, Jiadi Luo, Carla Erb, Richard Duerr, Kong Chen* 和 Wei Chen*

维护者

Hongyi Xin <gohongyi at gmail.edu>

要求

GMM-Demux 需要 python3 (>3.5)。

安装

GMM-Demux 可以直接从 PyPi 安装。或者它可以在本地构建和安装。

从 PyPi 安装 GMM-Demux。

pip3 install --user GMM_Demux

在某些操作系统中，默认情况下pip3链接到pip。对于这些操作系统，安装命令很简单：

pip install --user GMM_Demux

检查是否pip3链接到pipwith pip -V。

如果选择从 PyPi 安装 GMM-Demux，则无需从 github 下载 GMM-Demux。但是，我们仍然建议下载示例数据集以试用 GMM-Demux。

使用setuptools和 pip3在本地安装 GMM-Demux 。

克隆 github 存储库后，您可以选择在本地安装 GMM-Demux。但是，这仅适用于高级用户，不保证支持。该命令提供如下：

cd <GMM-Demux dir>
python3 setup.py sdist bdist_wheel
pip3 install --user . 

安装后流程

如果这是您第一次通过 pip 安装 python3 软件，请确保将 pip 二进制文件夹添加到您的PATH变量中。通常，pip 二进制文件夹位于~/.local/bin.

如果用户使用虚拟环境，pip 二进制文件夹可能位于不同的位置。注意 pip 安装输出。

这是一个示例安装输出。pip 二进制文件夹的路径突出显示：

要临时添加 pip 二进制文件夹，请运行以下命令：

export PATH=~/.local/bin:$PATH

要将 pip 库文件夹永久添加到您的PATH变量中，请将以下行附加到您的.bashrc文件中（假设 bash 是默认 shell）。

PATH=~/.local/bin:$PATH

内容

GMM-Demux 的源代码在GMM_Demux文件夹中提供。

还提供了一个示例单元散列数据集，位于该example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix文件夹中。

example_cell_types文件夹中提供了上述数据集的一组手动推定的细胞类型示例。使用表面标记表达数据通过手动门控对细胞类型进行注释。

上述单元散列数据集的示例 csv 格式作为example_hto.csv文件提供。

用法

案例1：基本用法，移除MSM

GMM-demux安装后，可以使用命令直接访问 GMM-Demux 。

GMM-demux <cell_hashing_path> <HTO_names>

<HTO_names>是一个样本标签 (HTO) 的列表，由 ',' 分隔，没有空格。例如，示例单元散列数据集中有四个示例条形码标签。它们是HTO_1、HTO_2、HTO_3、HTO_4。因此<HTO_names>变量是HTO_1,HTO_2,_HTO_3,HTO_4。

数据集的非 MSM 液滴（SSD）默认存储在当前目录下的GMM_Demux_mtx文件夹中。也可以通过-o标志指定输出路径。

示例命令

example_input文件夹中提供了一个示例单元格哈希数据。<HTO_names> 可以从 features.tsv 文件中获得。

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4

<HTO_names> 包含在 features.tsv 文件中。feature.tsv 文件的内容如下所示。

输出

输出文件夹中的默认内容是以 MTX 格式存储的非 MSM 液滴 (SSD)。输出与 CellRanger 3.0 共享相同的格式。默认情况下，输出存储在SSD_mtx文件夹中。输出位置可以用-o标志覆盖。

案例 2：计算 MSM 和 SSM 费率

要计算 MSM 和 SSM 速率，GMM-Demux 需要以下-u标志：

• -u 摘要，--summary 摘要生成数据集的统计摘要。需要在测定中估计的细胞总数作为输入。

该-u标志需要一个额外的 <NUM_OF_CELL> 参数，它是单细胞测定中估计的细胞总数。

示例命令

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -u 35685

输出

下面是一个示例报告：

• RSSM 表示剩余 SSD 中 SSM 的百分比（移除所有 MSM 后）。RSSM在移除 MSM 后测量最终单元散列数据集的质量。

案例 3：验证某个单元格类型是否存在

-eGMM-Demux 使用以下标志验证推定的单元类型是否存在：

• -e EXAMINE, --examine EXAMINE 提供单元格列表。需要一个文件参数。仅在设置了 -u 时执行。

该-e标志需要一个文件名，该文件名存储假定细胞类型的液滴条形码列表。

示例命令

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -u 35685 -e example_cell_types/CD19+.txt
GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -u 35685 -e example_cell_types/Doublets/CD3+CD4+CD19+.txt

输出

纯细胞类型的示例输出：

假细胞类型的示例输出：

案例 4：使用 csv 文件格式作为输入，而不是 mtx 格式

示例命令

GMM-demux -c example_hto.csv HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -u 35685

案例5：提取由样本标签组合标记的液滴

提取由多个样本条形码标签标记的液滴，带有以下-x标志：

• -x EXTRACT, --extract EXTRACT 要提取的样本条形码标签的名称，以“,”分隔。联合标签用“+”链接。

设置后-x，GMM-Demux 的其他功能将被关闭。

案例 5a：提取单个 HTO 样本

示例命令

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -x HTO_1

案例 5b：提取由多个 HTO 标签联合定义的单个 HTO 样本

用于+指定联合 HTO 标记。

示例命令

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -x HTO_1+HTO_2

案例 5c：提取多个 HTO 样本

用于,分隔样本标签。单标签样本可以与联合标签样本合并。

示例命令

GMM-demux example_input/outs/filtered_feature_bc_matrix HTO_1,HTO_2,HTO_3,HTO_4 -x HTO3,HTO_1+HTO_2,HTO_1+HTO_4+HTO_2

可选参数

• -h：显示帮助信息。
• -f FULL, --full FULL 生成完整的分类报告。需要一个路径参数。
• -s SIMPLIFIED, --simplified SIMPLIFIED 生成简化的分类报告。需要一个路径参数。
• -o OUTPUT, --output OUTPUT 存储相同样本液滴 (SSD) 的路径。SSD 以 mtx 格式存储。需要一个路径参数。默认路径：SSD_mtx。
• -r REPORT, --report REPORT 指定存储摘要报告的文件。需要一个文件参数。
• -c CSV, --csv 以 csv 格式输入，而不是 mmx 格式。
• -s SKIP, --skip FULL_REPORT 加载完整的分类报告并跳过 mtx 文件夹作为输入。需要一个路径参数。
• -a AMBIGUOUS, --ambiguous AMBIGUOUS 通过聚类算法将虚假 GEM 包含在纯类型 GEM 集群中的估计机会。需要浮点数 (0, 1)。默认值：0.05。仅在 -e 执行时执行。
• -t THRESHOLD, --threshold THRESHOLD 提供置信度阈值。需要 (0,1) 中的浮点数。默认值：0.8。

解析分类输出

分类输出文件夹中有两个文件。一个配置文件（以 .config 结尾）和一个分类文件（以 .csv 结尾）。

分类文件包含每个液滴的标签以及分类的概率。分类用配置文件中解释的数字表示。

下面显示了示例数据的分类输出：

在线单元散列实验规划器

一个基于 GMM-Demux 的在线单元散列实验计划器可在此处公开访问。

引文

如果您发现此代码对您的研究有用，请考虑引用：

@article{xin2019sample,
  title={Sample demultiplexing, multiplet detection, experiment planning and novel cell type verification in single cell sequencing},
  author={Xin, Hongyi and Yan, Qi and Jiang, Yale and Lian, Qiuyu and Luo, Jiadi and Erb, Carla and Duerr, Richard and Chen, Kong and Chen, Wei},
  journal={bioRxiv},
  pages={828483},
  year={2019},
  publisher={Cold Spring Harbor Laboratory}
}

致谢

特别感谢Zhongli Xu 测试GMM-Demux！