遵循 Unix 哲学的 Wetlab 协议。
项目描述
Stepwise 是一个用于编写、规划、执行和共享科学协议的程序。它旨在提供两个主要好处：
自动执行繁琐的计算/记住小细节。例如，计算如何设置预混液，记住哪些抗生素与哪些质粒一起使用，以理想的摩尔比将片段添加到 DNA 组装反应中，选择 PCR 反应的退火温度和延伸时间等。Stepwise 可以自动解决所有问题这些细节以及更多类似的细节。
记录每个实验的每一步。我们都知道我们应该仔细记录我们在实验室中所做的一切，但是必须为类似的实验反复写下类似的细节是乏味的，而且容易产生歧义或不一致。在您指定几个重要的细节之后，逐步填写所有的小细节来帮助您。
警告：此软件仍在进行中！
如果逐步似乎对您有用，我鼓励您尝试一下！我每天都在使用它，它确实很实用。但是，它还没有完成，而且肯定还没有打磨。让我知道（最好通过在错误跟踪器中打开一个问题）如果您很难理解任何事情应该如何工作，或者如果您遇到一个神秘的错误消息或类似的东西。我最终想把它变成一个对尽可能多的科学家有用的工具，从其他人那里获得反馈真的会有所帮助。
例子
一个例子使上面提到的好处更加清楚。下面是构建两个质粒的命令，分别命名为“p216”和“p217”：
$ sw make p216 p217
该协议需要知道这些质粒是什么，您可以通过 Excel 电子表格或类似的方式提供该信息；有关更多信息，请参见冷冻箱。以下是该电子表格中的一些相关条目：
质粒和片段：
姓名 |
准备好 |
合成 |
清理 |
|---|---|---|---|
p216 |
n |
吉布森 f169,f172 |
转换; 序列o266；小量制备 |
p217 |
n |
吉布森 f169,f173 |
转换; 序列o266；小量制备 |
f169 |
n |
pcr 模板=p186 引物=o359,sr71 |
自旋清理 |
f172 |
是的 |
订单供应商=IDT |
|
f173 |
是的 |
订单供应商=IDT |
寡核苷酸：
姓名 |
序列 |
|---|---|
o359 |
CAACATTTCCGTGTCGCCCT |
sr71 |
CCGGTTGTACCTATCGAGTG |
简而言之，这些表格描述了如何制作每个构造。例如，p216 是通过对 f169 和 f172 片段进行 Gibson 组装而制成的。反过来，f169 是通过以 p186 作为模板和 o359 和 sr71 作为引物进行 PCR 来制备的。
从要构建的结构名称、这些电子表格中的信息以及从 SnapGene 或 GenBank 文件中读取的序列信息，逐步生成以下协议：
$ sw make p216 p217
1. 准备 10x 底漆混合物 [1]：
试剂储备量
──────────────────────────
水 9.00 µL
o359 100 µM 0.50 µL
sr71 100 µM 0.50 µL
──────────────────────────
10.00 µL
2. 设置 1 PCR 反应 [2,3]：
试剂储备量
──────────────────────────────────
水 15.00 µL
p186 20 皮克/微升 5.00 微升
底漆混合 10x 5.00 µL
Q5 主混合物 2x 25.00 µL
──────────────────────────────────
50.00 µL
3. 运行以下热循环仪方案：
- 98°C 30 秒
- 重复 35 次：
- 98°C 持续 10 秒
- 63°C 持续 20 秒
- 72°C 4 分钟
- 72°C 2 分钟
- 4°C 保持
4. 产品标签：f169
5. 使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒进行纯化
(28104) [4,5]：
- 以 17900g 执行所有旋转步骤。
- 在粗 DNA 中加入 5 卷 PB。
- 如果不是黄色：添加 0.2 体积 3M 钠
醋酸盐，pH=5.0。
- 在 QIAquick 柱上加载。
- 旋转 30 秒；丢弃流通。
- 添加 750 µL PE。
- 旋转 30 秒；丢弃流通。
- 旋转 1m；丢弃流通。
- 添加 50 µL EB。
- 等待至少 1m。
- 旋转 30 秒；保持流通。
6. 设置 2 个 Gibson 组件 [6]：
试剂库存量 2.2x
──────────────────────────────────────────────
吉布森主混合 2x 2.50 µL 5.50 µL
f169 65 ng/uL 1.60 µL 3.51 µL
f172,f173 10 ng/µL 0.90 µL
──────────────────────────────────────────────
5.00 µL 4.10 µL/rxn
7. 50°C 孵育 15 分钟。
8. 产品标签：p216, p217
9. 转化以下质粒：p216、p217 [7]
- 预热 2 磅+碳水化合物板。
- 对于每个转换：
- 在冰上解冻 25 µL 主管 MACH1 细胞。
- 添加 1 µL 质粒。
- 轻弹混合。
- 板 25 µL 细胞。
- 在 37°C 下孵育 16 小时。
10. 对以下质粒进行测序：
质粒引物
────────────────
p216 o266
p217 o266
11. 小量制备。
笔记：
[1] 对于重悬冻干引物：
100 µM = 10 µL/nmol
[2] https://tinyurl.com/y27ralt4
[3] 将模板 DNA 稀释至 20 pg/µL：
将 1 µL 稀释两次至 7*sqrt([DNA]) µL
[4] https://tinyurl.com/xr8ruvr9
[5] 柱容量：10 µg
[6] https://tinyurl.com/ychbvkra
[7] https://tinyurl.com/2cesd2hv
请注意，我们只需要指定真正有意义的细节，例如要制作的结构、用于 PCR 的模板/引物等。逐步自动计算出其他所有内容，包括：
意识到 f169 需要在 p216 或 p217 之前制作。
意识到不需要制作 f172 和 f173 ，因为它们被标记为“就绪”。
选择所有 PCR 参数，包括每种试剂的体积和每个热循环仪步骤的温度/时间。这个例子中使用了 Q5 聚合酶，因为这是我订购的，但很容易配置其他供应商/混合物。退火温度和延伸时间取决于模板和引物的序列。
意识到两个程序集共享 f169 片段，因此可以将其包含在主混音中。
根据 PCR 反应的典型产量和硅胶离心柱的典型回收率估算 f169 片段的浓度。
选择所有 Gibson 组装参数，最显着的是给出推荐的骨架与插入物摩尔比的片段体积。
转化质粒时使用哪些抗生素。这来自于在质粒序列中寻找已知的抗生素抗性基因。
安装
从pip逐步安装：
$ pip install stepwise
您可能还想安装一些相关的软件包。首先是Stepwise — Molecular Biology，它是与分子生物学相关的预编程方案的集合，例如 PCR、Gibson/Golden Gate 组装、体外转录等：
$ pip install stepwise_mol_bio
第二个是FreezerBox，它允许您以可逐步访问的方式记录有关您的 DNA/蛋白质构建体的有用信息（例如序列、分子量、克隆策略等）：
$ pip install freezerbox
入门
Stepwise 旨在成为您可以用于您执行的每个协议的东西。然而，这是一个很大的承诺。只需逐步执行一些它真正擅长的任务，就更容易开始：
sw make : 见上面的例子。此命令非常适合常规克隆。基本工作流程是在计划时将克隆步骤记录在电子表格中，然后在所有引物等到达后逐步生成方案。需要冷冻箱。
sw future/reactions：此命令计算使用主混合物设置相关反应组的最佳方式。在需要 3-4 个主混音的复杂情况下，它确实显示出它的价值。它知道如何在每种混合中多做一点，并且可以解释各种复杂的反应设置。
快速提示：目前还没有任何逐步的在线文档，但是如果您使用-h标志，每个命令都有相当广泛的使用信息。例如：
$ sw future/reactions -h
