ribotricer：使用 Ribo-seq 数据准确检测短和长活性 ORF

高级访问论文

补充文件

安装

我们强烈建议您通过 conda 安装 ribotricer：

conda install -c bioconda ribotricer

要在本地安装，您可以从 release 下载源代码，也可以使用git clone. 拿到源代码后，请切换到源代码所在目录，输入

python setup.py install

注意：以上将安装以下依赖项：

pyfaidx>=0.5.0
pysam>=0.11.2.2
numpy>=1.11.0
pandas>=0.20.3
scipy>=0.19.1
matplotlib>=2.1.0
click>=6.0
click-help-colors>=0.3
quicksect>=0.2.0
tqdm>=4.23.4

如果其中一些已经存在，它们可能会被指定的版本替换。因此，我们强烈建议在安装之前 创建一个单独的环境（使用venvor ） ：condaribotricer

conda create -n ribotricer -c bioconda ribotricer

ribotricer 的工作流程

为了运行 ribotricer，您需要准备以下三个文件，包括：

• GTF 格式的基因组注释文件，支持 GENCODE 和 Ensembl 注释
• FASTA 格式的参考基因组文件
• BAM 格式的比对文件

准备候选 ORF

ribotricer 的第一步是通过 GTF 文件和 FASTA 文件找到所有候选 ORF。为了生成所有候选 ORF，请运行

ribotricer prepare-orfs --gtf {GTF} --fasta {FASTA} --prefix {RIBOTRICER_INDEX_PREFIX}

默认情况下，上述命令仅包含长度超过 60 nts 的 ORF，并且仅使用“ATG”作为起始密码子。--min_orf_length您可以通过包含选项和来更改设置--start_codons。

输出：{PREFIX}_candidate_orfs.tsv。

检测翻译的 ORF

ribotricer 的第二步是利用生成的索引文件prepare-orfs 和 BAM 文件通过评估所有候选 ORF 的周期性来检测主动翻译的 ORF：

ribotricer detect-orfs \
             --bam {BAM} \
             --ribotricer_index {RIBOTRICER_INDEX_PREFIX}_candidate_ORFs.tsv \
             --prefix {OUTPUT_PREFIX}

注意：默认情况下，上述命令使用 0.428 的相位分数截止值。我们针对特定物种推荐的截止值如下：

为了分配non-translating或translating状态，ribotricer 默认使用截止阈值0.428. 具有上述相位分数的 ORF0.428被标记为翻译，只要它们具有至少五个非零读取计数的密码子。默认情况下，ribotricer 不考虑覆盖来预测 ORF 正在翻译或不翻译。但是，可以通过以下过滤器更改此行为：

• --min_valid_codons（默认值 = 5）：用于确定活动翻译的具有非零读数的最小密码子数
• --min_valid_codons_ratio（默认=0）：具有非零读数的密码子与总密码子的最小比率，用于确定主动翻译
• --min_reads_per_codon（默认值=0）：每个密码子的最小读取数，用于确定主动翻译
• --min_read_density（默认值 = 0.0）：用于确定活动翻译的 ORF 总密码子上的最小读取密度（total_reads/length）

对于上述每个过滤器，未通过任何过滤器的 ORF都标记为non-translating。

例如，为了确保每个 ORF 至少有 3/4 的密码子是非空的，我们可以指定--min_valid_codons_ratio为 0.75：

ribotricer detect-orfs \
             --bam {BAM} \
             --ribotricer_index {RIBOTRICER_INDEX_PREFIX}_candidate_ORFs.tsv \
             --prefix {OUTPUT_PREFIX}
             --min_valid_codons_ratio 0.75

ORF 检测步骤由几个小步骤组成，包括：

1. 推断实验协议（reads
   的搁浅） 您可以使用 option 直接分配搁浅--stranded，它可以是“是”、“否”或“反向”。如果未提供此选项，ribotricer 将通过将读取链与参考进行比较来自动推断实验协议。

输出：{OUTPUT_PREFIX}_protocol.txt

2. 按链和读取长度拆分 bam 文件
   在此步骤中，将过滤所有映射的读取以仅包含唯一映射的读取。相对于从上一步提供或推断的链度，读取将按链和读取长度拆分。如果您只想包含某些读取长度，可以使用 option 分配它们--read_lengths。
   输出：{OUTPUT_PREFIX}_bam_summary.txt

3. 绘制读取长度分布
   在此步骤中，将绘制读取长度分布并用作质量控制
   输出：{OUTPUT_PREFIX}_read_length_dist.pdf

4. 计算元基因谱
   在此步骤中，通过与起始密码子或终止密码子对齐来计算每个读取长度的所有 CDS 转录本的元基因谱。
   输出：{OUTPUT_PREFIX}_metagene_profiles_5p.tsv 是与起始密码子对齐的元基因图谱，{OUTPUT_PREFIX}_metagene_profiles_3p.tsv 是与终止密码子对齐的元基因图谱

5. 绘制元基因图谱
   在这一步中，将绘制元基因图作为质量控制。
   输出：{OUTPUT_PREFIX}_metagene_plots.pdf

6. Align metagene profiles
   如果没有提供 P 位点偏移，这一步将使用互相关找出不同读长之间的相对偏移
   输出：{OUTPUT_PREFIX}_psite_offsets.txt

7. 根据 P 位点偏移合并来自不同读取长度的读取
   此步骤将通过移动 P 位点偏移来整合不同读取长度的读取

8. 导出 wig 文件
   在此步骤中导出一个 WIG 文件，用于在 Genome Browser
   输出中进行可视化：{OUTPUT_PREFIX}_pos.wig 用于正链，{OUTPUT_PREFIX}_neg.wig 用于负链。

9. 导出积极翻译的 ORF
   评估所有 ORF 配置文件的周期性并输出翻译的 ORF。无论翻译状态如何，您都可以使用选项--report_all
   输出输出所有 ORF：{OUTPUT_PREFIX}_translating_ORFs.tsv

ORF类型的定义

Ribotricer 报告八种不同的 ORF 类型，定义如下：

• annotated : 在提供的 GTF 文件中注释的 CDS
• super_uORF：注释CDS的上游ORF，不与同一基因的任何CDS重叠
• super_dORF：注释CDS的下游ORF，不与同一基因的任何CDS重叠
• uORF : 注释 CDS 的上游 ORF，不与主 CDS 重叠
• dORF : 注释 CDS 的下游 ORF，不与主 CDS 重叠
• overlay_uORF : 注释 CDS 的上游 ORF，与主 CDS 重叠
• overlay_dORF : 注释 CDS 的下游 ORF，与主 CDS 重叠
• 小说：非编码基因或编码基因的非编码转录本中的ORF

从数据中凭经验学习截止

Ribotricer 还可以从数据中凭经验学习截止值。给定至少一个 Ribo-seq 和一个 RNA-seq BAM 文件， ribotricer通过对提供的具有预先指定的截止值（ ，默认值：0.428）的文件运行算法的一次迭代来学习截止值--phase_score_cutoff，然后使用生成的输出找到中值差异仅候选 ORF 的 Ribo-seq 和 RNA-seq 相位分数之间transcript_type设置为protein_coding( --filter_by_tx_annotation)。

ribotricer learn-cutoff --ribo_bams ribo_bam1.bam,ribo_bam2.bam \
--rna_bams rna_1.bam \
--prefix ribo_rna_prefix \
--ribotricer_index {RIBOTRICER_ANNOTATION}

联系人和错误报告

安德鲁·D·史密斯 andrewds@usc.edu

Saket Choudhary skchoudh@usc.edu

李文政 wenzhenl@usc.edu

我们致力于为 Ribo-seq 数据分析打造最好的 ORF 检测器。如果您在这个项目中发现了错误或错误，我们很想知道它。不过，在您向我们发送错误报告之前，请检查以下内容：

1. 你用的是最新版本吗？您发现的错误可能已经修复。
2. 检查您的输入格式是否正确，并且您选择了正确的选项。
3. 请将您的输入减少到仍然产生错误的最小可能大小；我们将需要您的输入数据来重现问题，并且您可以做得越小，就越容易。

执照

Ribotricer 用于从 Ribo-seq 数据中检测主动翻译的 ORF 版权所有 (C) 2018 Andrew D Smith、Wenzheng Li、Saket Choudhary 和南加州大学

本程序是免费软件：您可以根据自由软件基金会发布的 GNU 通用公共许可证条款重新分发和/或修改它，许可证的第 3 版或（由您选择）任何更高版本。

分发此程序的目的是希望它有用，但不提供任何保证；甚至没有对适销性或特定用途适用性的默示保证。有关详细信息，请参阅 GNU 通用公共许可证。

您应该已经收到了一份 GNU 通用公共许可证的副本以及该程序。如果没有，请参阅http://www.gnu.org/licenses/。