拉菲

低丰度感知全长异构体簇

概述

LAFITE 被指定用于从 Nanopore Direct RNA-seq 数据中识别高度一致的全长异构体。LAFITE 结合了参考注释和 DRS 读取（TSS、TES、剪接点和读取多腺苷酸化事件）的多种特征，并且对低丰度转录本更敏感。

先决条件

• 床具
• 小地图2
• 纳米抛光
• 山姆工具
• 蟒蛇 3.7/3.8/3.9

安装

为避免潜在的冲突，我们建议在 conda 环境中运行 LAFITE。

conda create -n LAFITE_env -c bioconda python=3.7 bedtools
conda activate LAFITE_env
pip install git+https://github.com/TF-Chan-Lab/LAFITE

用法

1. 运行 minimap2 和 samtools 生成 bam 格式的对齐文件

   minimap2 -ax splice -u f -k 14 -G 500000 --secondary=no REFERENCE_FA FASTQ > ALIGNMENT_SAM
   samtools view -bS ALIGNMENT_SAM|samtools sort - > ALIGNMENT_BAM
   

   LAFITE 还支持其他可感知剪接的长读对齐工具。

2. 运行 Nanopolish polya 以生成读取多聚腺苷酸化结果（可选但推荐）
   当前的长读取测序技术（Nanopore cDNA/DRS 或 PacBio Iso-Seq）都旨在捕获带有 poly(A) 尾的 RNA 分子。然而，RNA 片段化和孔阻塞可能会带来相当一部分的截断读数，这会干扰下游分析。因此，LAFITE 利用 Nanopolish 报告的 read 多聚腺苷酸化状态来过滤已完成测序过程的 read。

   nanopolish index -d PATH_TO_FAST5 -s GUPPY_SEQUENCING_SUMMARY FASTQ
   nanopolish polya -t NUM_OF_THREADS -r FASTQ -b ALIGNMENT_BAM -g REFERENCE_FA > Nanopolish_PolyA_RES
   

   LAFITE 还提供了一种替代方法，通过扫描存在于读取 3' 端的任何 poly(A) 基序来估计读取多腺苷酸化状态。

3. 运行拉菲

   usage: lafite [-h] -b BAM [-B BEDTOOLS] -g GTF -f GENOME -o OUTPUT
             [-n MIN_COUNT_TSS_TES] [-i MIS_INTRON_LENGTH]
             [-c MIN_NOVEL_TRANS_COUNT] [-s MIN_SINGLE_EXON_COVERAGE]
             [-l MIN_SINGLE_EXON_LEN] [-L LABEL] [-p POLYA]
             [-m POLYA_MOTIF_FILE] [-r RELATIVE_ABUNDANCE_THRESHOLD]
             [-j SHORT_SJ_TAB] [-w SJ_CORRECTION_WINDOW] [--no_full_cleanup]
             [-t THREAD] [-T TSS_PEAK] [-d TSS_CUTOFF]
   
   Low-abundance Aware Full-length Isoform clusTEr
   
   optional arguments:
     -h, --help            show this help message and exit
     -b BAM                path to the alignment file in bam format
     -B BEDTOOLS           path to the executable bedtools
     -g GTF                path to the reference gene annotation in GTF format
     -f GENOME             path to the reference genome fasta
     -o OUTPUT             path to the output file
     -n MIN_COUNT_TSS_TES  minimum number of reads supporting a alternative TSS or TES, default: 3
     -i MIS_INTRON_LENGTH  length cutoff for correcting unexpected small intron, default: 150
     -c MIN_NOVEL_TRANS_COUNT
                           minimum occurrences required for a isoform from novel loci, default: 3
     -s MIN_SINGLE_EXON_COVERAGE
                           minimum read coverage required for a novel single-exon transcript, default: 4
     -l MIN_SINGLE_EXON_LEN
                           minimum length for single-exon transcript, default: 100
     -L LABEL              name prefix for output transcripts, default: LAFT
     -p POLYA              path to the file contains read Polyadenylation event
     -m POLYA_MOTIF_FILE   path to the polya motif file
     -r RELATIVE_ABUNDANCE_THRESHOLD
                           minimum abundance of the predicted multi-exon transcripts as a fraction of the
   						total transcript assembled at a given locus, default: 0.01
     -j SHORT_SJ_TAB       path to the short read splice junction file
     -w SJ_CORRECTION_WINDOW
                           edit distance to reference splicing site for splicing correction, default: 40
     --no_full_cleanup     keep all intermediate files
     -t THREAD             number of the threads, default: 4
     -T TSS_PEAK           path to the TSS peak file
     -d TSS_CUTOFF         minimum TSS distance for a transcript to be considered as a novel transcript
   

• LAFITE 可以使用以下参数运行：

  lafite -b ALIGNMENT_BAM -g REFERENCE_GTF -f REFERENCE_FA -o OUTPUT_GTF -t NUM_OF_THREADS -p Nanopolish_PolyA_RES
  

• LAFITE 也可以在没有nanoplish polya的结果的情况下运行。然后，必须为相应的物种提供 Poly(A) 基序列表。
  我们提供了从Tian等人检索到的人和小鼠的 Poly(A) 基序列表。.

  lafite -b ALIGNMENT_BAM -g REFERENCE_GTF -f REFERENCE_FA -o OUTPUT_GTF -t NUM_OF_THREADS -m POLYA_MOTIFS_OF_SPECIES
  

• LAFITE 接受来自 5' 端 CAGE 数据的 TSS 峰，以识别高置信度 TSS。用户可以按以下格式准备 TSS 数据，其中：

  • 第一列是染色体名称
  • 第二列是 TSS 峰值从 0 开始的起始位置
  • 第三列是 TSS 峰从 1 开始的结束位置
  • 第四列是股线信息

• LAFITE 还接受来自 Illumina 短读长 RNA-seq 数据的剪接点来证明长读长。LAFITE 支持来自 STAR aligner 的 SJ.out.tab。用户还可以按以下格式准备拼接点，其中：

  • 第一列是染色体名称
  • 第二列是拼接点从0开始的起始位置
  • 第三列是从 1 开始的拼接点末端位置
  • 第四列是股线信息

发展

LAFITE 是按照fastai/nbdev框架开发的。