checkv 1.0.1

CheckV 是一个全自动命令行管道，用于评估单重叠群病毒基因组的质量，包括识别整合前病毒的宿主污染、估计基因组片段的完整性以及识别封闭基因组。

安装

安装 CheckV 的三种方法：

• 使用 conda（推荐）：conda install -c conda-forge -c bioconda checkv

• 使用 docker：见下文

• 使用点子：pip install checkv

如果您决定通过 安装 CheckV pip，请确保您还安装了以下外部依赖项：

• 钻石（v2.0.4）：https ://github.com/bbuchfink/diamond
• HMMER (v3.3)：http ://hmmer.org/
• Prodigal-gv (v2.6.3): https://github.com/apcamargo/prodigal-gv

上面列出的版本是经过适当测试的版本。不同的版本也可以工作。

CheckV 数据库

如果您使用安装conda或pip需要下载数据库：

checkv download_database ./

您需要更新您的环境或使用-d标志来指定CHECKVDB位置：

export CHECKVDB=/path/to/checkv-db

一些用户可能希望使用自己的完整基因组更新数据库：

checkv update_database /path/to/checkv-db /path/to/updated-checkv-db genomes.fna

快速开始

有两种方法可以运行 CheckV：

• 使用单个命令运行完整的管道（推荐）：

checkv end_to_end input_file.fna output_directory -t 16

• 对管道中的每个步骤使用单独的命令：

checkv contamination input_file.fna output_directory -t 16
checkv completeness input_file.fna output_directory -t 16
checkv complete_genomes input_file.fna output_directory
checkv quality_summary input_file.fna output_directory

• 有关 checkv 程序和选项的完整列表，请使用：checkv -h和checkv <program> -h

码头工人使用

• 拉取镜像（包括数据库）

docker pull antoniopcamargo/checkv

• 运行镜像

docker run -ti --rm -v " $( pwd ) :/app" antoniopcamargo/checkv end_to_end input_file.fna output_directory -t 16

• 注意：docker 镜像可能不代表最新版本

已知的问题

• 对于 0.9.0，您可能会收到一些浪费任务失败的错误。这将在下一个版本中修复。现在使用更少的线程重新运行。
• 对于 >=0.9.0，如果您收到未找到钻石数据库的错误，请使用重新下载数据库checkv download_database
• 对于 v0.8.1，有时 conda 安装了旧版本的 DIAMOND 导致错误。确保 conda 已安装 DIAMOND 版本 >= 2.0.9

输出文件

quality_summary.tsv

这包含来自三个主要模块的综合结果，应该是参考的主要输出。下面是一个示例，用于演示您可以在数据中预期的结果类型：

在示例中，上面有 6 个病毒重叠群的结果：

• 第一个 5325 bp contig 没有完整性预测，这由“checkv_quality”字段的“Not-determined”指示。该重叠群也没有鉴定出病毒基因，因此它甚至可能不是病毒。
• 第二个 41803 bp 重叠群被归类为“低质量”，因为其完整性 <50%。这是基于“AAI”方法的估计。请注意，quality_summary.tsv 文件中仅报告了高置信度或中等置信度估计值。您可以查看“completeness.tsv”以获取更多详细信息。此 contig 有一个 DTR，但由于某种原因被标记（有关详细信息，请参阅 complete_genomes.tsv）
• 第三个重叠群被认为是“中等质量”，因为它的完整性估计为 80%，这是基于“HMM”方法的。这意味着基于 AAI 估计完整性太新颖了，但与 CheckV 参考基因组共享一个 HMM。请注意，此值表示下限（意味着真实完整性可能高于但不低于此值）。请注意，此重叠群也被归类为前病毒。
• 第四个重叠群基于 >90% 的完整性被归类为高质量。但是，请注意“kmer_freq”的值为 1.7。这表明病毒基因组在重叠群中多次表示。这些情况非常罕见，但需要注意。
• 第五个重叠群基于直接末端重复 (DTR) 的存在被分类为完全，并且基于 AAI 方法具有 100% 的完整性。该序列可以放心地视为完整的基因组。

完整性.tsv

关于如何估计完整性的详细概述：

在示例中，上面有 4 个病毒重叠群的结果：

• 使用基于 AAI 的方法 (100 x 5713 / 53242.8)，第一个前病毒重叠群的估计完整性为 10.7%。此估计的置信度很高，基于 3.7% 的相对估计误差，这又基于与 CheckV 参考 DTR_517517 的 aai_id（平均氨基酸同一性）和 aai_af（重叠群的比对分数）
• 第二个重叠群使用基于 AAI 的方法具有 100% 的完整性，使用基于 HMM 的方法具有 75-100% 的完整性范围。请注意，重叠群长度比预期的基因组长度 37,309 bp 长一点。
• 根据 AAI 方法，估计第三个 contig 完成了 65.8%。然而，我们不能那么相信这一切，因为 aai_confidence 很低（意味着基于 AAI 的最高命中相当弱）。保守起见，我们可能希望报告基于 HMM 方法的完整性范围（52-70%）
• 最后一个 contig 没有任何基于 AAI 的命中，也没有任何病毒 HMM，所以我们对此序列无话可说

污染.tsv

如何估算污染的详细概述：

在示例中，上面有 4 个病毒重叠群的结果：

• 第一个重叠群不是预测的前病毒
• 第二个重叠群的预测宿主区域覆盖 2182 bp
• 第三个 6930 bp 重叠群在左侧有一个宿主区域
• 第四个 101630 bp contig 有 103 个基因，包括 7 个病毒基因和 24 个宿主基因。CheckV 确定了两个宿主病毒边界

完整基因组.tsv

确定的推定完整基因组的详细概述：

在示例中，上面有 5 个病毒重叠群的结果：

• 第一个病毒重叠群具有 253 bp 的直接末端重复。根据估计的完整性 > 90%，它被归类为高置信度
• 第二个病毒重叠群具有 20 bp 的 DTR，但 DTR 复杂性低且不可信，导致置信度低。DTR 也出现 10 次，被认为是重复的。
• 第三个病毒重叠群的 DTR 为 26857 bp！这表明基因组的很大一部分是重复的。CheckV 将这些分类为低置信度，但用户可以手动解决这些重复
• 第四个病毒重叠群的 ITR 为 91 bp。这被认为是基于 AAI 的完整性 > 80% 的中等置信度
• 第五个病毒重叠群的两侧是宿主（原病毒）。但是 CheckV 无法评估完整性，因此置信度为未确定

经常问的问题

问：基于 AAI 和 HMM 的完整性有什么区别？ 答：基于 AAI 的完整性产生一个估计的完整性值，该值被设计为非常准确，并且在报告的置信度为中或高时可以信任。在基于 AAI 的完整性不可靠的情况下，基于 HMM 的完整性给出了 90% 的完整性置信区间（例如 30-75%）。在这个例子中，我们可以 90% 确定（理论上）完整性在 30% 到 75% 之间。

问：kmer_freq 字段的含义是什么？ 答：这是衡量病毒基因组在重叠群中出现多少次的指标。大多数时候，这非常接近 1.0。在极少数情况下，可能会发生组装错误，其中重叠群序列代表病毒基因组的多个连接拷贝。在这些情况下，基因组拷贝数将超过 1.0。

问：为什么我的 DTR contig 的估计完整性小于 100%？ 答：如果估计的完整性接近 100%（例如 90-110%），那么查询很可能已完成。然而，有时不完整的基因组片段可能包含直接末端重复 (DTR)，在这种情况下，我们应该期望它们的估计完整性小于 90%，有时甚至更少。在其他情况下，重叠群将真正是循环的，但估计的完整性是不正确的。如果查询多部分基因组的完整片段（常见于 RNA 病毒），也可能发生这种情况。默认情况下，CheckV 使用 90% 的完整性截止值进行验证，但用户可能希望在这些模棱两可的情况下做出自己的判断。

问：为什么当我的序列具有高污染时被认为是“高质量”的？ 答：CheckV 仅根据完整性确定序列质量。主机污染很容易去除，因此不计入这些质量等级。

问：我进行了分箱并生成了病毒 MAG。我可以在这些上使用 CheckV 吗？ 答：CheckV 可以估计这些的完整性，但不能估计污染。在运行 CheckV 之前，您需要将每个 MAG 的重叠群连接成一个序列。

问：我可以使用 CheckV 从整个（元）基因组中预测（原）病毒吗？ 答：可能，虽然这还没有经过测试。

问：我可以使用 CheckV 去除假阳性病毒预测吗？ 答：可能，虽然这还没有经过测试。具有至少 1 个病毒基因和比宿主基因更多病毒的序列可能是真正的病毒。

问：如果没有完整的估计，我应该如何处理假定的“封闭基因组”？ 答：在某些情况下，您将无法验证带有末端重复或原病毒整合位点的序列的完整性。DTR 是一个相当可靠的指标（>90% 的时间），并且可能在没有完整性估计的情况下被信任。然而，完整的前病毒和 ITR 是不太可靠的指标，因此需要 >90% 的估计完整性。

问：为什么我的 contig 被归类为“质量未定”？ 答：当序列不匹配任何具有足够高相似性的 CheckV 参考基因组以自信地估计完整性并且没有任何病毒 HMM 时，就会发生这种情况。对此有一些解释，按可能出现的频率顺序排列：1）您的 contig 非常短，并且碰巧它与 CheckV 参考不共享任何基因，2）您的 contig 来自一种非常新颖的病毒，它是远亲对于 CheckV 数据库中的所有基因组，3）您的 contig 根本不是病毒，因此与任何参考文献都不匹配。

问：我应该如何处理“未确定质量”的序列？ 答：虽然无法估计这些的完整性，但您仍可以选择分析超过一定长度（例如 >30 kb）的序列。

问：CheckV 是否对我的序列进行分类注释？ 答：CheckV 不执行病毒重叠群的分类注释。但是，一些分类信息可供用户自行查找。您可以通过查看分类法（以及源环境）来自己实现这一点，以获得基因组数据库的热门搜索。首先，您可以从“completeness.tsv”输出文件的“aai_top_hit”字段中找到热门信息。然后，您可以查找热门歌曲的分类。如果顶部命中以“DTR”开头，请查看“checkv_circular.tsv”数据库文件中的“世系”字段。您也可以在这里查看“栖息地”字段。对于以“GCA”开头的 GenBank 参考资料，请查看“checkv_genbank.tsv”中的“vog_clade”或“lineage”字段

问：为什么 CheckV 输出中包含 0 个病毒基因的序列 目前，CheckV 假设输入序列代表病毒并尝试估计它们的质量。一些输入序列可能来自细菌、质粒或其他来源，因此可能检测到 0 个病毒基因。

支持代码

基于成对 ANI 的快速基因组聚类

首先，创建一个blast+数据库： makeblastdb -in <my_seqs.fna> -dbtype nucl -out <my_db>

接下来，使用 blast+ 包中的 megablast 来执行序列的 all-vs-all blastn： blastn -query <my_seqs.fna> -db <my_db> -outfmt '6 std qlen slen' -max_target_seqs 10000 -o <my_blast.tsv> -num_threads 32

注意：使用 -perc_identity 标志会以敏感度为代价加快搜索速度： blastn -query <my_seqs.fna> -db <my_db> -outfmt '6 std qlen slen' -max_target_seqs 10000 -perc_identity 90 -o <my_blast.tsv> -num_threads 32

接下来，通过组合序列对之间的局部比对来计算成对 ANI： anicalc.py -i <my_blast.tsv> -o <my_ani.tsv>

最后，使用 MIUVIG 推荐参数（95% ANI + 85% AF）执行类似 UCLUST 的聚类： aniclust.py --fna <my_seqs.fna> --ani <my_ani.tsv> --out <my_clusters.tsv> --min_ani 95 --min_tcov 85 --min_qcov 0

这个怎么运作

管道可以分为 4 个主要步骤：

A：去除原病毒上的宿主污染

• 基于与 HMM 的自定义数据库的比较，基因首先被注释为病毒或微生物
• CheckV 扫描 contig（5' 到 3'），比较一对相邻基因窗口之间的基因注释和 GC 内容
• 此信息用于计算每个基因间位置的分数并识别宿主病毒断点
• 宿主病毒断点通过以下方式标识：
  • 高分 (>1.2)
  • 在假定的宿主区域中至少有 2 个宿主特异性基因（对于具有 >=10 个基因的重叠群）
  • 在假定的病毒区域中至少有 2 个病毒特异性基因（对于具有 >=10 个基因的重叠群）
  • 在假定的宿主区域中至少有 30% 的基因被注释为微生物

B：估计基因组完整性（2 个算法）

• 基于 AAI 的方法（基因组完整性的准确点估计；如上图所示）
  • 首先，使用 AAI（平均氨基酸同一性）将蛋白质与 CheckV 基因组数据库进行比较
  • 在识别出最高命中后，完整性被计算为重叠群长度（或前病毒的病毒区域长度）与匹配参考基因组长度之间的比率
  • 根据比对的强度和重叠群的长度报告置信水平
  • 一般来说，高和中置信度的估计是相当准确的，可以信赖
• 基于 HMM 的方法（基因组完整性的估计范围）
  • 高度新颖的病毒可能与具有足够 AAI 的 CheckV 基因组不匹配（即低置信度估计）
  • 在这些情况下，CheckV 识别重叠群上的病毒 HMM（参见图 A）并将重叠群长度与共享相同 HMM 的参考基因组进行比较
  • CheckV 然后返回基因组完整性的估计范围（例如 35% 到 60% 的完整性），它表示基于具有相同病毒 HMM 的参考基因组长度分布的 90% 置信区间

C：预测封闭基因组（3 个特征）

• 直接末端重复 (DTR)
  • 在 contig 的开始/结束处重复 >20-bp 的序列
  • 我们经验中最受信任的签名
  • 可能表示从环状模板（即多联体）复制的环状基因组或线性基因组
• 原病毒
  • 在 5' 和 3' 末端具有预测宿主边界的病毒区域（见面板 A）
  • 注意：如果宿主区域已经被移除（例如使用 VIBRANT 或 VirSorter），CheckV 将不会检测到原病毒
• 反向末端重复序列 (ITR)
  • 重叠群开始/结束处 >20-bp 的重复序列（3' 重复反转）
  • 在我们的经验中最不可信的签名

CheckV 还将根据与完整性估计的比较报告置信水平（面板 B）：

• 高置信度：>90% 的估计完整性
• 中等置信度：估计完整性为 80-90%
• 低置信度：<80% 估计的完整性

对于 DTR 和 ITR，CheckV 执行一些额外的过滤/检查：

• 重复中不明确的碱基（例如“NNNNN”）：<= 20% 的重复序列，Ns
• 重复模式碱基频率（例如“AAAAA”）：<= 75% 的重复序列由单碱基组成
• 重复序列的最大出现次数：<= 每个 contig 8 次（去除高度重复的序列）
• 最大 kmer 频率：<= 1.5（删除背靠背重复的具有相同基因组的重叠群）

D：总结质量。

根据 AC 的结果，CheckV 生成一个报告文件并将查询重叠群分配给五个质量层之一（与 MIUViG 质量层一致并扩展）：

• 完整（高或中等置信度预测；见面板 C）
• 高质量（>90% 完整性）
• 中等质量（50-90% 的完整性）
• 低质量（<50% 的完整性）
• 质量未定